Tìm kiếm
Đang tải khung tìm kiếm
Kết quả 1 đến 1 của 1

    TIẾN SĨ Tách chiết, phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch kết hợ

    D
    dream dream Đang Ngoại tuyến (18524 tài liệu)
    .:: Cộng Tác Viên ::.
  1. Gửi tài liệu
  2. Bình luận
  3. Chia sẻ
  4. Thông tin
  5. Công cụ
  6. Tách chiết, phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch kết hợ

    Luận án tiến sĩ năm 2011
    Đề tài: Tách chiết, phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao


    MỤC LỤC
    Trang
    Lời cam đoan . i
    Lời cảm ơn ii
    Mục lục . iii
    Danh mục các chữviết tắt . viii
    Danh mục hình . x
    Danh mục bảng xiv
    ĐẶT VẤN ĐỀ . 1
    CHƯƠNG 1: TỔNG QUANTÀI LIỆU 4
    1.1. TỔNG QUAN VỀAFLATOXIN 4
    1.1.1. Phát hiện aflatoxin 4
    1.1.2. Aspergillus flavusvà aflatoxin . 4
    1.1.3. Tính chất hóa, lý của aflatoxin 5
    1.1.4. Độc tính của aflatoxin 8
    1.1.5. Giới hạn của aflatoxin trong thực phẩm 10
    1.1.6. Giới hạn aflatoxin trong dược liệu 12
    1.2. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN . 12
    1.2.1.Lấy mẫu . 12
    1.2.2. Chuẩn bịmẫu 12
    1.2.3. Phân tích mẫu 16
    - iv -1.3. NHỮNG NGHIÊN CỨU CHẾTẠO CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC MIỄN DỊCH
    CHO AFLATOXIN 23
    1.3.1. Kháng thể . 23
    1.3.2. Cộng hợp kháng nguyên aflatoxin –BSA 24
    1.3.3. Tạo kháng thểkháng aflatoxin . 26
    1.3.4. Tinh chếkháng thể 30
    1.3.5. Cốđịnh kháng thểvào pha rắn . 31
    1.3.6. Các đặc tính chiết xuất pha rắn của chất hấp thụái lực miễn dịch 34
    CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . 38
    2.1. VẬT LIỆU 38
    2.1.1. Thiết bị . 38
    2.1.2. Hóa chất . 38
    2.2. PHƯƠNG PHÁP 40
    2.2.1. Phương pháp gây miễn dịch tạo kháng thểkháng aflatoxin . 40
    2.2.2. Phương pháp khuếch tán kép trên thạch . 41
    2.2.3. Phương pháp tinh chếkháng thểdùng muối amoni sulfat 42
    2.2.4. Phương pháp thẩm tích (đưa protein ởdạng tủa trởlại dạng dung dịch)42
    2.2.5. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamid có natri dodecyl sulfat . 43
    2.2.6. Xác định nồng độprotein bằng phương pháp Bradford . 45
    2.2.7. Cộng hợp protein vào gel sepharose CL-4B hoạt hóa với CNBr . 45
    - v -2.2.8. Phương pháp nén cột . 45
    2.2.10. Pha dung dịch aflatoxin chuẩn . 46
    2.2.11. Phương pháp chiết aflatoxin từmẫu cần phân tích bằng cột IAC 47
    2.2.12. Phương pháp chiết aflatoxin từmẫu cần phân tích bằng cột SPE C18. 47
    2.2.13. Phương pháp làm giảmẫu nhiễm aflatoxin . 48
    2.2.14. Phương pháp tạo dẫn xuấtcác aflatoxin 48
    2.2.15. Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo phân tích aflatoxin 48
    2.2.16. Phương pháp khảo sát các thông sốkỹthuật của cột sắc ký ái lực bắt
    aflatoxin . 48
    2.2.16.1. Độlặp lại của các cột . 48
    2.2.16.2. Dung lượng cột 49
    2.2.16.3. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng . 49
    2.2.16.4. Xác định độtuyến tính . 50
    2.2.16.5. Xác định hiệu suất thu hồi . 50
    2.2.16.6. Theo dõi độ ổn định của cột . 51
    CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 52
    3.1. CHẾTẠO CỘT SẮC KÍ ÁI LỰC CHO AFLATOXIN . 52
    3.1.1. Sản xuấtkháng thểkháng aflatoxin . 52
    3.1.1.1. Gây miễn dịch trên thỏ . 53
    3.1.2. Chếtạo cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin 58
    3.1.2. Chếtạo cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin 59
    3.1.1.2. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch 54
    2.2.9. Phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch 46
    - vi -3.1.2.1. Chọn nồng độkháng thểliên kết với gel ái lực . 59
    3.1.2.2. Khảo sát các thông sốkỹthuật của cột IAC Pasteur . 63
    3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢNĂNG ỨNG DỤNG CỘT IAC-PASTEURCHO PHÂN
    TÍCH AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU . 68
    3.2.1. Khảo sát trên mẫu thực phẩm 68
    3.2.1.1. Khảo sát trên mẫu ngô . 68
    3.2.1.2. Khảo sát trên mẫu lạc 76
    3.2.2. Khảo sáttrên mẫu dược liệu . 81
    3.2.2.1. Khảo sát trên mẫu cam thảo 81
    3.2.2.2. Khảo sát trên mẫu gừng . 87
    3.3. SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬLÝ MẪU KHÁC 92
    3.3.1. So sánh với phương pháp xửlý m ẫu bằng cột SPE C18 . 92
    3.3.1.1. Trên nền mẫu thực phẩm 92
    3.3.1.2. Trên nền mẫu dược liệu . 96
    3.3.2. So sánh với phương pháp xửlý m ẫu bằng cột sắc ký ái lực của hãng
    Vicam . 99
    3.3.2.1. So sánh trên mẫu cộng chuẩn . 99
    3.3.2.2. So sánh trên mẫu thực . 103
    3.4. ÁP DỤNG CỘT IAC-PASTEUR LÀM SẠCH MẪU ĐỊNH LƯỢNG
    AFLATOXIN TRÊN MỘT SỐNỀN MẪU THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU 105
    3.4.1. Trên một sốnền mẫu thực phẩm 105
    - vii -3.4.2. Trên một sốnền mẫu dược liệu 106
    CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 107
    4.1. BÀN LUẬN VỀCHẾTẠO CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC CHO AFLATOXIN 107
    4.1.1. Vềsản xuấtkháng thể kháng aflatoxin 107
    4.1.1.1. Vềgây miễn dịch trên thỏ .107
    4.1.1.2. Vềkiểm tra đáp ứng miễn dịch 109
    4.1.2. Vềchếtạo cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin 111
    4.1.2.1. Vềchọn nồng độkháng thểliên kết vào gel ái lực 111
    4.1.2.2. Vềkhảo sát các thông sốkỹthuật của cột IAC Pasteur 112
    4.2. BÀN LUẬN VỀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỘT IAC-PASTEUR CHO
    PHÂN TÍCH AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU . 114
    4.3. BÀN LUẬN VỀSO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬLÝ MẪU KHÁC 118
    4.3.1. Với phương pháp xửlý mẫu bằng cột SPE C18 118
    4.3.2. Với phương pháp xửlý mẫu bằng cột IACcủa hãng Vicam . 121
    4.4. BÀN LUẬN VỀ ÁP DỤNG CỘT IAC-PASTEUR ĐỂ XÁC ĐỊNH
    AFLATOXIN TRONG MỘT SỐTHỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU . 122
    KẾT LUẬN VÀ ĐỀXUẤT 125
    DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 127
    TÀI LIỆU THAM KHẢO
    PHỤ LỤC


    ĐẶT VẤN ĐỀ
    Aflatoxin thuộc nhóm cácchất chuyển hóa có độc tính cao, được tiết ra từ các vi
    nấm Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus. Điều kiện thời tiết nóng, ẩm, mưa
    nhiều ở Việt Nam rất thích hợp cho các loại vi nấm này phát triển mạnh và sản xuất ra
    aflatoxin.Aflatoxin thường nhiễm trên cácloại thực phẩm thiết yếu cho người và vật
    nuôi như gạo, ngô, lạc, đậu, cám
    Người bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc có aflatoxin hoặc ăn các sản
    phẩm như thịt, cá, trứng, sữa lấytừ động vật được nuôi bằng thức ăn nhiễm aflatoxin.
    Dùng các chất chỉthịsinh học theo dõi trong suốt 10-15 năm, ngườita nhận thấy rằng
    ngay từlúc còn là bào thai, con ngườiđãtiếp xúc với aflatoxin và sẽtiếp xúc liên tục
    trong suốt cuộc đời sau này [79]. Nhiễm độc aflatoxin gây ra một loạt các triệu chứng
    cấp tính và mạn tính. Nhiễm độc cấp có thểgây chết người. Nhiễm độc mạn thường
    biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, tổn thương gan.Nhiễm độcmạn tính tác động
    đếnyếu tốdi truyền tương ứng với3 kiểu gây ung thư, quái thai và đột biến [26][93].
    Ảnh hưởngquan trọng nhất dẫn đến việc phải kiểm soát gắt gao hàm lượng aflatoxin
    trong thựcphẩm là khả năng gây ung thư tế bào gan nguyên phát. Tổ chức nghiên cứu
    ung thư quốc tế (IARC) đã xếp aflatoxin vào nhóm I: các chất gây ung thư cho người
    [56].
    Do độc tính của aflatoxin,đã có ít nhất 99 quốc gia trên thếgiới (trong đó có Việt
    Nam) đưara các tiêu chuẩn vềgiới hạn của aflatoxin trong thực phẩm [28] đồng thời
    quy định, hướng dẫn phương pháp phân tích xác định chúng.
    Tất cả các kỹ thuật dùng định lượng aflatoxin, trừ kỹ thuật miễn dịch men
    (ELISA), đều cần phải có giai đoạn làm sạch mẫu. Đểtránh bất lợi của phương pháp
    chiết xuất lỏng-lỏng, xu thếhiện nay là thay thếnó bằng phương pháp chiết xuất pha
    rắn (SPE). Các pha rắn khác nhau đã được sửdụng cho mục đích này như: Florisil,
    - 2 -
    silicagel-C18
    và gần đây nhất là cột Mycosep đa chức năng. Chiết xuất pha rắn có ưu
    điểm hơn chiết xuất lỏng-lỏng là dễthao tác hơn và cho kết quả có độlặp lại cũng như
    độthu hồi tốt hơn. Bất lợi chủyếu của phương pháp này là độchọn lọc thấp. Gần đây,
    cột sắc ký ái lực miễn dịch dựa trên kháng thể(Immuno affinity column-IAC)đã được
    phát triển đểthay thếcho các phương pháp làm sạch pha rắn cổđiển. Ngoài các ưu
    điểm như dễthao tác, độthu hồi và độlặp lại cao, cột IAC có ưu điểm vượt trội so với
    cột SPE là có độchọn lọc cao, giúp phân tách dễdàng aflatoxin trên các nền mẫu phức
    tạp từmẫu thức ăn, mẫu sinh học đếnmẫu mô động vật. Phương pháp làm sạch này
    ngày càng được sửdụng nhiều trong phân tích aflatoxin và là phương pháp bắt buộc sử
    dụng đối với các sản phẩm xuất khẩu. Sau giai đoạn làm sạch mẫu, người ta phát hiện
    aflatoxin dựa trên đặc tính phát huỳnh quangcủa nó. AFB1
    và AFG1
    cần biến đổi thành
    dẫn xuất AFB2a
    và AFG2a
    có khảnăng phát huỳnh quang mạnh hơn. Phương pháp tạo
    dẫn xuất đơn giản nhất là sử dụng acid trifluoroacetic (TFA) để xúc tác phản ứng
    [123]. Phương pháp HPLC với đầu dò huỳnh quang là phương pháp phát hiện
    aflatoxin chính xác và hiệu quả.
    Song song với việc cải thiện và nâng cao chất lượng cuộc sống của người dân
    Việt Nam, nhu cầu đảm bảo chất lượng an toàn vệsinh thực phẩm ngày càng cao. Số
    lượng và chủng loại mẫu được yêu cầu kiểm tra aflatoxin ngày càng nhiều và đa dạng.
    Qui trình kiểm tra aflatoxin sẽđơn giản và chính xác hơn khi sửdụng cột IAC đểlàm
    sạch mẫu. Hiện nay, cột IAC cho aflatoxin dùng tại Việt Nam đều được nhập từnước
    ngoài với giá thành khá cao. Đây chính là nguyên nhân làm h ạnchếviệc thay thếcột
    SPE bằng cột IAC trong qui trình kiểm tra aflatoxin tại các phòng xét nghiệm trong
    nước. Do đó, có được qui trình sản xuất cột IAC cho aflatoxin trong nước với giá thành
    phù hợp là rất cần thiết. Xuất phát từcơ sởkhoa học và yêu cầu thực tiễn vềphân tích
    aflatoxin nêu ởtrên, tôi tiến hành nghiên cứu đềtài luận án:
    “Tách chiết, phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký
    ái lực miễn dịch kết hợpsắc ký lỏng hiệu năng cao”.
    - 3 -Mục tiêu của luận án là:
    - Nghiên cứu chếtạo cột sắc ký ái lực cho aflatoxin
    - Đánh giá khảnăng phân tích aflatoxin trên mẫu thực phẩm và dược liệu bằng
    phương pháp làm sạch mẫu với cột sắc ký ái lực miễn dịch và định lượng aflatoxin
    bằng sắc ký lỏng cao áp với đầu dò huỳnh quang.
    Đềtài bao gồm các nội dung sau:
    1. Chếtạo cột sắc ký ái lực miễn dịch cho aflatoxin.
    2. Đánh giá khảnăng ứng dụng cột sắc ký ái lực cho phân tích aflatoxin trong
    thực phẩm và dược liệu.
    3. So sánh việc xửlý mẫu bằng cột sắc ký ái lực tựchếtạo với một sốphương
    pháp xửlý mẫu khác.
    4. Áp dụng cột sắc ký ái lực đểxác định aflatoxin trong một sốthực phẩm và
    dược liệu.


    CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
    1.1. TỔNG QUAN VỀAFLATOXIN:
    1.1.1 Phát hiện aflatoxin:
    Aflatoxinthuộc nhóm các độc tốcó nguồn gốc từvi nấm. Aflatoxinđược phát
    hiện lần đầu vào khoảng 50 năm trước, khi đi tìm nguyên nhân gây dịch bệnh và gây
    chết cho gà tây[12] cũng như gây ung thư cho cá[99].Sau đó, nguyên nhân được xác
    định là do chúng ăn thức ăn có chứa lạc và hạt bông bị nhiễm nấm Aspergillus flavus.
    Phân tích thức ăn, người ta tìm ra tác nhân gây chết là một sốchất chuyển hóa thứcấp
    có độc tính của nấm. Các chất này được gọi là Aflatoxin(Aspergillus flavus toxin).
    Aflatoxinđược sinh ra từmột nhóm sinh vật có quan hệ gần gũi của loài aspergilli: A.
    flavus, A. parasiticusvà A. nomius. Gần đây, A. ochraceoroseusvà A. tamarii đã được
    thêm vào danh sách này [39].
    1.1.2. Aspergillus flavusvàaflatoxin :
    A. flavuslà loài vi nấm chủyếu sản xuất ra aflatoxin(Hình1.1), được phân bố
    rộng khắp thếgiới, đặc biệt là các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, có khảnăng gây
    nhiễm trên nhiều loại thực phẩm khác nhau. Các vùng địa lý nằm giữa vĩtuyến 40
    Bắc và 40Namcủa đường xích đạo có điều kiện thuận lợi đểnấm Aspergillus flavus
    sản xuất aflatoxin.
    Hình 1.1:Bào tử trần và bộ máy mang bào tử trần của loài Aspergillus flavus [59]


    TÀI LIỆU THAM KHẢO
    TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
    [1] Bộnông nghiệp và phát triển nông thôn (2001), Quy định vềđộc tốAflatoxin B1
    và Aflatoxin tổng sốcủa Việt Nam, Số104/2001/QĐ/BNN.
    [2] BộY tế(2008), Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong
    thực phẩm, Nhà xuất bản Hà Nội.
    [3] Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000), Vi nấm dùng trong công nghệsinh
    học, Nhà xuất bản khoa học và kỹthuật.
    [4] Trần Trịnh Công (2008), Phân lập và nghiên cứu khảnăng sinh độc tốcủa một
    số nấm mốc trên một số v ị thuốc đông dược của Việt Nam, Báo cáo kết quả
    nghiên cứu đềtài cấp BộY tế.
    TÀI LIỆU TIẾNG ANH
    [5] AFRO (2006), Food Safety Newsletter World Health Organization.
    [6] Ali N (2005), “Evaluation of a method to determine the natural occurrence of
    aflatoxins in commercial traditional herbal medicines from Malaysia and
    Indonesia”, Food and Chemical Toxicology, 43, pp. 1763 -1772.
    [7] Alimentarius C. (1993), “Joint FAO/WHO Food standards Programme”, Food
    Agriculture Organization, Rome, Italy, 3, pp. 59.
    [8] Amersham Pharmacia Biotech (2001), “Affinity chromatography: principles and
    methods”, The company.
    [9] AOAC (1988), AOAC Official Method, 968.22.
    [10] Aziz N.H., Yussef Y.A., El-Fouly M.Z., Moussa L.A. (1998), “Contamination
    of some common medicinal plant samples and spices by fungi and their
    mycotoxins”, Botanical Bulletin of Academia Sinica, 39, pp. 279 -285.
    [11] Bagnati R., Paleologo-Oriundi M., Ubaldi A., Fanelli R. (1990), “Analysis of
    diethylstilbestrol, dienestrol and hexestrol in biological samples by
    immunoaffinity extraction and gas chromatography -negative-ion chemical
    ionization mass spectrometry”, J. Chromatogr, 527, pp. 267-278.
    [12] Blount WP. (1961), “Turkey "X" disease”, J Br Turk Fed 9, pp.52-54.
    [13] Buchi G., Foulkes D.M., Kurono M., Mitchell G.F. (1966), “The total synthesis
    of racemic aflatoxin B1”, J. Am. Chem. Soc, pp.88.
    [14] Bullock E., Robert J.C, and Underwood J. G. (1962), “Studies in mycological
    chemistry. Part Xl. The structure of isosterigmatocystin and an amended
    structure for sterigmatocystin”, J. Chem. Soc, pp.4179-4183.
    [15] Carisano A., Della Torre G. (1986), “Sensitive reversed-phase highperformance liquid chromatographic determination of aflatoxin M1 in dry
    milk”, J. Chromatogr, 335, pp. 340.
    [16] Carlos A. F., Oliveira NBG, Roice E. Rosim, and Andrezza M. Fernandes
    (2009), “Determination of Aflatoxins in Peanut Products in the Northeast
    Region of São Paulo, Brazil”, Int J Mol Sci, 10, pp. 174 -183.
    [17] Cepeda A., Fente C. A., Vázquez B. I., Rodríguez J. L., Prognon P. and
    Mahuzier G. (1996), “Postcolumn excitation of aflatoxins using cyclodextrins in
    liquid chromatography for food analysis”, J. Chromatogr. A, 721, pp. 69-74.
    [18] ChangH.L., De Vries J.W.(1983), “Rapid high pressure liquid chromatographic
    determination of aflatoxin M1 in milk and nonfat dry milk”, J. Assoc. Off. Anal.
    Chem, 66, pp. 913-917.
    [19] Chu F.S., Ueno I. (1977), “Production of antibody against aflatoxin B
    1
    ”, Appl
    Environ Microbiol, 33, pp. 1125-1128.
    [20] Clarke W., Jackson A., Reynolds B., Karle E.M., Hage D.S. (2000), “Antibody
    immobilization to high-performance liquid chromatography supports:
    Characterization of maximum loading capacity for intact immunoglobulin G and
    Fab fragments”, J. Chromatogr. A, 888.
    [21] Cohen H., Lapointe M. (1981), “HPLC determination and fluorescence
    detection of aflatoxins in corn and dairy feeds”, J. Assoc. Off Anal. Chem, 64,
    pp. 1372-1376.

    Xem Thêm: Tách chiết, phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch kết hợ
    Nội dung trên chỉ thể hiện một phần hoặc nhiều phần trích dẫn. Để có thể xem đầy đủ, chi tiết và đúng định dạng tài liệu, bạn vui lòng tải tài liệu. Hy vọng tài liệu Tách chiết, phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch kết hợ sẽ giúp ích cho bạn.
    #1
  7. Đang tải dữ liệu...

    Chia sẻ link hay nhận ngay tiền thưởng
    Vui lòng Tải xuống để xem tài liệu đầy đủ.

    Gửi bình luận

    ♥ Tải tài liệu

social Thư Viện Tài Liệu
Tài liệu mới

Từ khóa được tìm kiếm

Nobody landed on this page from a search engine, yet!

Quyền viết bài

  • Bạn Không thể gửi Chủ đề mới
  • Bạn Không thể Gửi trả lời
  • Bạn Không thể Gửi file đính kèm
  • Bạn Không thể Sửa bài viết của mình
  •  
DMCA.com Protection Status